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　　2ღ◈、06.01) (54)发明名称 肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒及其制备方 法 (57)摘要 本发明提供了一种肌酸激酶同工酶MB检测 试剂盒及其制备方法ღ◈。 具体地杉本知春ღ◈， 所述试剂盒包括 肌酸激酶同工酶MB检测试剂卡ღ◈， 所述试剂卡包 括ღ◈： 预加样部件和测试条ღ◈； 其中ღ◈， 所述预加样部件 包括加样容器和预加在所述加样容器内的肌酸 激酶同工酶MB单克隆抗体荧光微球偶联物ღ◈； 所 述测试条包括ღ◈： 测试条底板ღ◈， 以及设置在所述测 试条底板上的上样部件ღ◈、 检测部件和吸液部件ღ◈； 和所述检测部件包括层析基质和分别设置的检 测带和质控带ღ◈， 其中ღ◈， 所述检测带包被有肌酸激 酶同工酶CKMB多克隆抗体ღ◈， 且所述质控带包被 有Iღ◈。

　　3ღ◈、gG多克隆抗体ღ◈。 本发明的试剂盒操作简单ღ◈、 成 本低且重复性好ღ◈、 准确度高ღ◈。 权利要求书2页 说明书11页 附图1页 CN 111879930 A 2020.11.03 CN 111879930 A 1.一种肌酸激酶同工酶MB检测试剂卡ღ◈， 其特征在于ღ◈， 所述试剂卡包括ღ◈： 预加样部件和测试条ღ◈； 其中ღ◈， 所述预加样部件包括加样容器和预加在所述加样容器内的肌酸激酶同工酶MB单 克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈； 所述测试条包括ღ◈： 测试条底板ღ◈， 以及设置在所述测试条底板上的上样部件ღ◈、 检测部件和 吸液部件ღ◈； 和 所述检测部件包括层析基质和分别设置的检测带和质控带ღ◈， 其中ღ◈， 所述检测带包被有 肌酸激酶同工酶CKღ◈。

　　4ღ◈、-MB多克隆抗体ღ◈， 且所述质控带包被有IgG多克隆抗体ღ◈。 2.如权利要求1所述的试剂卡ღ◈， 其特征在于ღ◈， 预加的所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗 体-荧光微球偶联物为通过将溶液A滴加在所述加样容器内干燥后形成的固相混合物ღ◈， 所述 溶液A包括ღ◈： (a)缓冲液ღ◈， 所述缓冲液包括ღ◈： PB 10-50mMღ◈、 甘油0.5-5wtღ◈、 海藻糖或蔗糖0.5-5wtღ◈、 防腐剂0.01-0.4wtღ◈， 且pH为6.0-9.5ღ◈； 和 (b)经封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物贝博ballbet体育ღ◈。 3.如权利要求2所述的试剂卡ღ◈， 其特征在于ღ◈， 所述缓冲液包括ღ◈： PB10-50mMღ◈、 甘油0.5- 5wtღ◈、 海藻糖或蔗糖0.5ღ◈。

　　5ღ◈、-5wtღ◈、 Tween 20或Tween 800.5-5wtღ◈、 PEG 0.1-0.5wtღ◈、 防腐 剂0.01-0.4wtღ◈， 且pH为6.0-9.5ღ◈。 4.如权利要求2所述的试剂卡ღ◈， 其特征在于ღ◈， 溶液A中ღ◈， 所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗 体-荧光微球偶联物浓度0.3mg/mL-1mg/mLღ◈， 较佳地为0.4mg/mL-0.7mg/mLღ◈， 更佳地为0.5- 0.6mg/mLღ◈。 5.如权利要求1所述的试剂卡ღ◈， 其特征在于ღ◈， 所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体选自下 组ღ◈： 鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体ღ◈、 兔源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体ღ◈、 羊源肌酸激酶 同工酶MB单克隆抗体或人源肌酸激酶同工酶ღ◈。

　　6ღ◈、MB单克隆抗体ღ◈， 或其组合ღ◈； 优选为鼠源肌酸激 酶同工酶MB单克隆抗体ღ◈。 6.如权利要求1所述的试剂卡ღ◈， 其特征在于ღ◈， 所述预加样部件与所述测试条设置在同一 基板上ღ◈。 7.一种肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒ღ◈， 其特征在于ღ◈， 所述试剂盒包括ღ◈： (a)如权利要求1所述的试剂卡ღ◈； 以及 (b)任选地样品管ღ◈、 吸液管和/或说明书ღ◈。 8.一种检测肌酸激酶同工酶MB的方法ღ◈， 其特征在于ღ◈， 所述方法包括步骤ღ◈： (a)提供如权利要求1所述的试剂卡或如权利要求2所述的试剂盒ღ◈； (b)将样本加入所述加样容器ღ◈， 使样本与加样容器中预加的所述肌酸激酶同工酶MB单 克隆抗体-荧光微球偶联物接触并反应ღ◈， 形成待测混合液ღ◈； ღ◈。

　　7ღ◈、和 (c)将所述待测混合液上样至所述上样部件并层析ღ◈， 荧光检测获得检测区的显色情况ღ◈。 9.如权利要求1所述的试剂卡ღ◈， 其特征在于ღ◈， 所述样本选自下组ღ◈： 血清ღ◈、 血浆ღ◈、 尿液ღ◈、 胸腹 水ღ◈、 脑脊液ღ◈、 组织标本ღ◈、 细胞培养上清液ღ◈。 10.一种肌酸激酶同工酶CK-MB检测试剂卡或试剂盒的制备方法ღ◈， 其特征在于ღ◈， 所述方 法包括制备加样部件ღ◈， 其中包括步骤ღ◈： (i)将含有肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的溶液滴加至加样容器上ღ◈， 权利要求书 1/2 页 2 CN 111879930 A 2 干燥所述溶液ღ◈， 从而形成所述加样部件ღ◈。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111879930 A 3 ღ◈。

　　8ღ◈、肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及荧光免疫层析检测领域ღ◈， 更具体地涉及使用荧光免疫层析法ღ◈， 定量检 测临床样本中CK-MB的试剂盒ღ◈。 背景技术 0002 急性心肌梗死(AMI)已经成为威胁人类生命的主要疾病之一ღ◈， 目前全球每年有 1700万人死于心血管疾病ღ◈， 其中有一半以上死于急性心肌梗死ღ◈， AMI过程中心肌细胞中的 酶ღ◈， 如肌酸激酶(CK)在血清中活性增高ღ◈， 可广泛应用于AMI的诊断ღ◈。 0003 肌酸激酶(CK)是由脑型亚单位B和肌型亚单位M组成的二聚体ღ◈， 每个亚单位的分子 量都约为43kDaღ◈， M亚基与B亚基在一级结构上的同源性达80ღ◈， 在高级结构上会ღ◈。

　　9ღ◈、形成3中二 聚体ღ◈， 有CK-MMღ◈、 CK-BBღ◈、 CK-MB三种同工酶ღ◈。 人体很多组织中都含有肌酸激酶ღ◈， 但是每一种同 工酶的分布都不一样ღ◈， 骨骼肌中富含有CK-MM型同工酶ღ◈， 脑ღ◈、 胃ღ◈、 小肠ღ◈、 膀胱及肺主要含有CK- BB同工酶贝博ballbet体育ღ◈， 而CK-MB型同工酶仅存在于心肌组织中ღ◈。 CK-MB同工酶诊断透壁型心肌梗死的敏 感性及特异性均极高ღ◈， CK-MB在正常条件下其表达水平较低ღ◈， 在发病后4-8小时CK-MB从受损 细胞排出并迅速开始在血液中增加ღ◈， 在12-24小时后达到最高水平ღ◈， 并在24-48小时内恢复 正常ღ◈。 若CK-MB同工酶在急性心肌梗死(AMI)后仍保持高水平ღ◈， 表明心肌坏死还在进行ღ◈；ღ◈。

　　10ღ◈、 若恢 复正常后再次升高ღ◈， 表明原梗死部位扩展或者新的梗死部位出现ღ◈。 因此ღ◈， 定量检测血液中 CK-MB型同工酶水平ღ◈， 对心肌梗死的诊断及心肌手术后的效果监测有着极高的医学价值ღ◈。 目 前ღ◈， CK-MB同工酶的定量诊断主要是基于化学发光的大型仪器ღ◈， 这些方法成本高ღ◈、 操作复杂ღ◈， 检测时间较长ღ◈， 且多是依赖于国外进口ღ◈， 昂贵的成本导致医院检测价格居高不下ღ◈。 0004 所以ღ◈， 本领域急需提供操作简单ღ◈、 成本低ღ◈、 重复性好ღ◈、 准确度高的CK-MB检测试剂 盒ღ◈。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种操作简单ღ◈、 成本低ღ◈、 重复性好ღ◈、 准确度高的CK-MB检测试 剂盒ღ◈。 0006 本发明第一方面ღ◈， 提ღ◈。

　　11ღ◈、供了一种肌酸激酶同工酶MB检测试剂卡ღ◈， 所述试剂卡 0007 包括ღ◈： 0008 预加样部件和测试条ღ◈； 0009 其中ღ◈， 所述预加样部件包括加样容器和预加在所述加样容器内的肌酸激酶同工酶 MB单克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈； 0010 所述测试条包括ღ◈： 测试条底板ღ◈， 以及设置在所述测试条底板上的上样部件ღ◈、 检测部 件和吸液部件ღ◈； 和 0011 所述检测部件包括层析基质和分别设置的检测带和质控带ღ◈， 其中ღ◈， 所述检测带包 被有肌酸激酶同工酶CK-MB多克隆抗体ღ◈， 且所述质控带包被有IgG多克隆抗体ღ◈。 0012 在另一优选例中ღ◈， 预加的所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物为 说明书 1/11 ღ◈。

　　12ღ◈、页 4 CN 111879930 A 4 通过将溶液A滴加在所述加样容器内干燥后形成的固相混合物ღ◈， 所述溶液A包括ღ◈： 0013 (a)缓冲液ღ◈， 所述缓冲液包括ღ◈： PB 10-50mMღ◈、 甘油0.5-5wtღ◈、 海藻糖或蔗糖0.5- 5wtღ◈、 防腐剂0.01-0.4wtღ◈， 且pH为6.0-9.5ღ◈； 和 0014 (b)经封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈。 0015 在另一优选例中ღ◈， 所述防腐剂选自下组ღ◈： Proclinღ◈、 NaN3ღ◈， 或其组合ღ◈。 0016 在另一优选例中ღ◈， 所述缓冲液的pH为7.0-9.0ღ◈， 较佳地8.0-9.0ღ◈。 0017 在另一优选例中ღ◈， 所述缓冲液包括ღ◈： Pღ◈。

　　15ღ◈、ღ◈、 兔源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体ღ◈、 羊源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗 体或人源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体ღ◈； 优选为鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体ღ◈。 0032 在另一优选例中ღ◈， 所述IgG多克隆抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体ღ◈。 0033 在另一优选例中ღ◈， 所述检测带设置在靠近上样部件一侧ღ◈； 而所述质控带设置在靠 近吸液部件一侧ღ◈。 0034 在另一优选例中ღ◈， 所述检测带和质控带平行设置ღ◈。 0035 在另一优选例中杉本知春ღ◈， 所述检测带和质控带的宽度各自独立的为0.1-5mmღ◈， 较佳地ღ◈， 0.5-3mmღ◈， 更佳地ღ◈， 0.8-2mmღ◈。 0036 在另一优选例中ღ◈， 所述检测带和质控带的宽度基本相等ღ◈。 003ღ◈。

　　16ღ◈、7 在另一优选例中ღ◈， 所述检测带和质控带之间的距离为2-5cmღ◈， 较佳地ღ◈， 3-4cmღ◈。 0038 在另一实施例中ღ◈， 所述质控线和检测带彼此平行设置在检测部件上ღ◈。 0039 在另一优选例中ღ◈， 所述上样部件杉本知春ღ◈、 检测部件(硝酸纤维素膜)和吸液部件依次连续 设置ღ◈。 0040 在另一优选例中ღ◈， 所述层析基质为硝酸纤维素膜ღ◈。 说明书 2/11 页 5 CN 111879930 A 5 0041 在另一实施例中ღ◈， 所述检测部件两端上表面以部分重叠方式粘连上样部件和吸液 部件ღ◈。 0042 在另一实施例中ღ◈， 所述的上样部件ღ◈、 检测部件和吸液部件通过粘连贴合在所述测 试条底板一侧ღ◈。 0043 在另一优选例中ღ◈， ღ◈。

　　17ღ◈、所述预加样部件与所述测试条设置在同一基板上ღ◈。 0044 在另一实施例中ღ◈， 所述基板是硬质基片贝博ballbet体育ღ◈。 0045 在另一优选例中ღ◈， 所述加样容器为上方开口的小室(如加样杯)ღ◈。 0046 在另一优选例中ღ◈， 所述加样容器的容积为0.01-2cm3ღ◈， 较佳地ღ◈， 0.05-1cm3ღ◈， 更佳地ღ◈， 0.1-0.8cm3ღ◈。 0047 在另一优选例中ღ◈， 所述加样容器的内表面不或基本上不与加入其中的检测试剂和 样本产生物理吸附和化学反应ღ◈。 0048 在另一优选例中ღ◈， 所述加样容器为塑料材质ღ◈。 0049 在另一实施例中杉本知春ღ◈， 所述试剂卡还包括卡盒ღ◈， 所述卡盒由下盖和上盖组成ღ◈， 所述加样 部件和测试条完全设置于下盖中ღ◈， 上盖设ღ◈。

　　18ღ◈、有加样窗口ღ◈、 上样窗口和读卡窗口ღ◈， 所述加样窗 口ღ◈、 上样窗口和读卡窗口分别对应于所述预加样部件ღ◈、 上样部件和检测部件ღ◈。 0050 在另一优选例中ღ◈， 所述卡盒的上盖上设有产品编号区和指示条形码区ღ◈。 0051 在另一优选例中ღ◈， 所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物中ღ◈， 所述荧 光微球选自下组ღ◈： 100nm-500nm乳胶微球ღ◈， 200-400nm乳胶微球ღ◈， 300-400nm乳胶微球ღ◈。 0052 本发明第二方面ღ◈， 提供了一种肌酸激酶同工酶MB检测试剂盒ღ◈， 所述试剂盒包括ღ◈： 0053 (a)如本发明第一方面所述的试剂卡ღ◈； 以及 0054 (b)任选地样品管ღ◈、 吸液管和/或说明书ღ◈。 00ღ◈。

　　19ღ◈、55 本发明第三方面ღ◈， 提供了一种检测肌酸激酶同工酶MB的方法ღ◈， 所述方法包括步骤ღ◈： 0056 (a)提供如本发明第一方面所述的试剂卡或如本发明第二方面所述的试剂盒ღ◈； 0057 (b)将样本加入所述加样容器ღ◈， 使样本与加样容器中预加的所述肌酸激酶同工酶 MB单克隆抗体-荧光微球偶联物接触并反应ღ◈， 形成待测混合液ღ◈； 和 0058 (c)将所述待测混合液上样至所述上样部件并层析ღ◈， 荧光检测获得检测区的显色 情况ღ◈。 0059 在另一优选例中ღ◈， 所述检测为定量检测或定性检测ღ◈。 0060 在另一优选例中ღ◈， 所述显色情况为检测线与检测线加上质控线 在另一优选例中ღ◈， 步骤(a)中ღ◈， 所述ღ◈。

　　20ღ◈、样本体积为10 L-50 Lღ◈， 最佳为25-30 Lღ◈。 0062 在另一优选例中ღ◈， 步骤(b)中贝博ballbet体育ღ◈， 所述反应的时间为8min-12minღ◈， 最佳为10minღ◈。 0063 在另一优选例中ღ◈， 所述样本选自下组ღ◈： 血清ღ◈、 血浆ღ◈、 尿液ღ◈、 胸腹水ღ◈、 脑脊液ღ◈、 组织标 本ღ◈、 细胞培养上清液ღ◈。 0064 本发明第四方面ღ◈， 提供了一种肌酸激酶同工酶CK-MB检测试剂卡或试剂盒的制备 方法ღ◈， 所述方法包括制备加样部件ღ◈， 其中包括步骤ღ◈： 0065 (i)将含有肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的溶液滴加至加样容 器上ღ◈， 干燥所述溶液ღ◈， 从而形成所述加样部件ღ◈。 0066 在另一优选例中ღ◈， 所述含有肌酸激ღ◈。

　　21ღ◈、酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的溶 液为溶液Aღ◈， 所述溶液A包括ღ◈： 说明书 3/11 页 6 CN 111879930 A 6 0067 (a)缓冲液ღ◈， 所述缓冲液包括ღ◈： PB 10-50mMღ◈、 甘油0.5-5wtღ◈、 海藻糖或蔗糖0.5- 5wtღ◈、 防腐剂0.01-0.4wtღ◈， 且pH为6.0-9.5ღ◈； 0068 (b)经封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈。 0069 在另一优选例中ღ◈， 所述干燥为减压干燥ღ◈， 较佳地ღ◈， 线 在另一优选例中ღ◈， 所述干燥的温度为20-30ღ◈， 最佳为25ღ◈。 0071 在另一优选例中ღ◈， 在步骤(i)之前ღ◈， 所述方法还包括步骤ღ◈： ღ◈。

　　22ღ◈、0072 (i-1)将肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体和活化的荧光微球反应ღ◈， 得到肌酸激酶同 工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈； 0073 (i-2)用封闭液封闭所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈， 得到经 封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈； 和 0074 (i-3)将所述经封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物溶于缓冲 液中ღ◈， 得到所述含有肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的溶液ღ◈。 0075 在另一优选例中ღ◈， 步骤(i-1)中ღ◈， 所述荧光微球通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基 碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化ღ◈。ღ◈。

　　25ღ◈、检测部件的层析基质上ღ◈， 所述肌酸激酶同工酶CK-MB多 克隆抗体渗入层析基质后形成检测带ღ◈， IgG多克隆抗体形成质控带ღ◈； 0091 (iii)在测试条底板上分别依次粘贴上样部件ღ◈、 形成有检测带和质控带的检测部 件ღ◈、 和吸液部件ღ◈； 和 0092 (iv)按照要求切割成适当宽度后与所述预加样部件装入卡盒中ღ◈， 从而形成试剂 卡ღ◈。 0093 应理解ღ◈， 在本发明范围内中ღ◈， 本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 说明书 4/11 页 7 CN 111879930 A 7 体描述的各技术特征之间都可以互相组合ღ◈， 从而构成新的或优选的技术方案ღ◈。 限于篇幅ღ◈， 在 此不再一一累述ღ◈。 附图说明 0094 ღ◈。

　　26ღ◈、图1为一个实施例的试剂卡结构示意图ღ◈； 1.预加样部件ღ◈； 2.预加的鼠源肌酸激酶同 工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈； 3.测试条底板ღ◈； 4.上样部件ღ◈； 5.层析基质ღ◈； 6.检测带ღ◈； 7.质控带ღ◈； 8.吸液部件ღ◈； 9.基板ღ◈。 0095 图2为本发明的试剂卡与结合垫式试剂卡检测临床样本相关性对比ღ◈。 具体实施方式 0096 本发明人经过广泛而深入的研究ღ◈， 通过大量筛选和测试ღ◈， 提供了一种肌酸激酶同 工酶CK-MB检测试剂卡ღ◈。 与本领域常用的将与待测物反应的免疫检测试剂负载在结合垫上 的形式相比ღ◈， 本发明的检测试剂卡将肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物滴加 在加样区并干燥ღ◈， 使用时ღ◈， 将样ღ◈。

　　27ღ◈、本滴加在加样区并溶解所述偶联物ღ◈， 两者可以最大程度的接 触并反应ღ◈， 从而显著提高了检测的重复性ღ◈、 灵敏度和准确性ღ◈。 在此基础上完成了本发明ღ◈。 0097 本发明人还发现ღ◈， 当使用本发明优选的缓冲液溶解肌酸激酶同工酶MB单克隆抗 体-荧光微球偶联物时ღ◈， 在所述加样区预加并干燥后ღ◈， 得到的含有肌酸激酶同工酶MB单克隆 抗体-荧光微球偶联物的固相混合物ღ◈， 所述固相混合物中含有缓冲液基质ღ◈， 所述缓冲液基质 的存在能够使所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物在样品中迅速溶解并充 分反应ღ◈， 从而使试剂卡的检测时间缩短且检测效果进一步提高ღ◈。 0098 术语 0099 除非另有定义ღ◈， 否则本文中所用的ღ◈。

　　28ღ◈、全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属 领域普通技术人员通常理解的相同含义ღ◈。 0100 如本文所用ღ◈， 在提到具体列举的数值中使用时ღ◈， 术语 “约” 意指该值可以从列举的 值变动不多于1ღ◈。 例如ღ◈， 如本文所用ღ◈， 表述 “约100” 包括99和101和之间的全部值(例如ღ◈， 99.1ღ◈、 99.2ღ◈、 99.3ღ◈、 99.4等)ღ◈。 0101 如本文所用ღ◈， 术语 “含有” 或 “包括(包含)” 可以是开放式ღ◈、 半封闭式和封闭式的ღ◈。 换 言之贝博ballbet体育ღ◈， 所述术语也包括 “基本上由构成” ღ◈、 或 “由构成” ღ◈。 0102 如本文所用ღ◈， 术语 “室温” 是指温度为4-40ღ◈， 较佳地ღ◈， 255ღ◈。 0103 在本发明中ღ◈， ღ◈。

　　29ღ◈、术语 “荧光微球” 与 “荧光乳胶微球” 可互换使用ღ◈。 0104 CK-MB免疫检测试剂卡 0105 免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的膜检测技术ღ◈， 对于大分子(如蛋 白质)物质而言ღ◈， 通常采用双抗体夹心法ღ◈。 0106 通常ღ◈， 通过双抗体夹心法原理进行免疫层析的试剂盒包括ღ◈： 上样部件ღ◈、 检测部件和 吸液部件ღ◈。 以检测CK-MB为例ღ◈， 上样部件(结合垫)中固定有待测物的CK-MB单克隆抗体-标记 物偶联物ღ◈、 检测部件上设置有检测带和质控带ღ◈， 所述检测带上固定有待测物的CK-MB多克隆 抗体Bღ◈。 将样本从加样窗滴到至上样部件后ღ◈， 如果样本中存在CK-MBღ◈， 则其与单克隆抗体A-标 记物偶联ღ◈。

　　30ღ◈、物反应生成CK-MB-单克隆抗体A-标记物偶联物ღ◈， 通过毛细管效应ღ◈， 分析物到达检 测带ღ◈， 并形成多克隆抗体B-CK-MB-单克隆抗体A-标记物偶联物(可显色)ღ◈； 未与CK-MB结合的 说明书 5/11 页 8 CN 111879930 A 8 单克隆抗体A-标记物偶联物继续前进到达质控带ღ◈， 与检测带中包被的多克隆抗体C反应形 成多克隆抗体C-单克隆抗体A-标记物偶联物(可显色)ღ◈。 0107 目前ღ◈， 用于免疫分析的标记物主要包括胶金ღ◈、 荧光素(荧光微球)ღ◈、 量子点ღ◈、 上转换 纳米粒子等ღ◈。 0108 本发明人发现杉本知春ღ◈， 上述试剂盒存在如下缺点ღ◈： a.因结合垫中标记抗体释放不均造成 检测重复性差ღ◈； bღ◈。

　　31ღ◈、.被检测物通过结合垫时ღ◈， 与标记抗体反应不充分ღ◈， 造成检测灵敏度低ღ◈。 0109 经过大量的筛选测试ღ◈， 本发明提供了一种肌酸激酶同工酶MB检测试剂卡ღ◈， 所述试 剂卡包括ღ◈： 测试条和加样部件ღ◈， 其中所述预加样部件包括加样容器和预加在所述加样容器 内的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈。 0110 通常ღ◈， 所述测试条包括上样部件ღ◈、 检测部件和吸液部件ღ◈。 0111 本发明中ღ◈， 与现有技术相比ღ◈， 不同之处在于ღ◈， 所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体- 荧光微球偶联物没有固定于上样部件上ღ◈， 而是预加于预加样部件上ღ◈。 0112 本发明中ღ◈， 对所述上样部件没有特别要求ღ◈， 可采用本领域常用的上样部件ღ◈。 优ღ◈。

　　32ღ◈、选 地ღ◈， 所述上样部件有利于样本的层析(如玻纤材质)ღ◈。 0113 本发明中ღ◈， 对所述检测部件没有特别要求ღ◈， 可采用本领域常用的检测部件ღ◈。 优选 地ღ◈， 所述检测部件有利于样本的层析和抗体的包被ღ◈， 如所述检测部件为硝酸纤维素膜ღ◈。 0114 本发明中ღ◈， 对所述吸液部件没有特别要求ღ◈， 可采用本领域常用的吸液部件ღ◈。 优选 地ღ◈， 所述吸液部件有利于吸收液体ღ◈。 0115 本发明中ღ◈， 对所述质控线中包被的抗体没有特别要求ღ◈， 可以用本领域常用的方法 选择合适的抗体ღ◈， 其中ღ◈， 所述抗体能与所用的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联 物结合ღ◈， 如IgG多克隆抗体ღ◈。 优选地ღ◈， 当所述CK-MB单克隆抗体为鼠源时ღ◈。

　　33ღ◈、ღ◈， 所述质控线采用羊 抗鼠IgG多克隆抗体ღ◈。 0116 通常ღ◈， 上样部件ღ◈、 检测部件ღ◈、 吸液部件依次设置ღ◈。 优选地ღ◈， 设置在同一底板上ღ◈。 0117 本发明中ღ◈， 加样部件与所述测试条可以设置在固定的相对位置ღ◈， 或分开设置ღ◈。 优选 地ღ◈， 所述加样部件设置在加样部件之前ღ◈。 或与测试条不处于同一基板上ღ◈， 在此情况下ღ◈， 加样 部件可以方便的设置在任何有利于加入样本和转移样本的位置ღ◈。 优选地ღ◈， 所述加样部件和 测试条设置在同一卡盒中ღ◈。 0118 在本发明中ღ◈， 对所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体没有特别要求ღ◈， 可以使用本领 域常用的合格的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体ღ◈。 例如(但并不限于)ღ◈， 鼠源肌酸激酶同工ღ◈。

　　34ღ◈、酶 MB单克隆抗体ღ◈、 兔源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体ღ◈、 羊源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体或 人源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体ღ◈。 0119 在本发明中ღ◈， 对所述肌酸激酶同工酶MB多克隆抗体没有特别要求ღ◈， 可以使用本领 域常用的合格的肌酸激酶同工酶MB多克隆抗体ღ◈。 通常ღ◈， 所述多克隆抗体具有至少一个与所 述单克隆抗体与CK-MB的结合位点不同的CK-MB结合位点ღ◈。 0120 特别优选地ღ◈， 预加的所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物为通过 将溶液A滴加在所述加样容器内干燥后形成的ღ◈， 所述溶液A包括ღ◈： 0121 (a)缓冲液ღ◈， 所述缓冲液包括ღ◈： PB 10-50mMღ◈、 甘油0.5-5wtღ◈。

　　35ღ◈、ღ◈、 海藻糖或蔗糖0.5- 5wtღ◈、 防腐剂0.01-0.4wtღ◈， 且pH为6.0-9.5ღ◈； 和 0122 (b)经封闭的肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈。 说明书 6/11 页 9 CN 111879930 A 9 0123 通常ღ◈， 本发明的试剂盒的检测原理ღ◈： 采用免疫荧光双抗体夹心法定量检测人血浆 中肌酸激酶同工酶CK-MB的浓度ღ◈。 具体地ღ◈， 将待测样本加到含有肌酸激酶同工酶MB单克隆抗 体-荧光微球偶联物的于加样杯中ღ◈， 反应一定时间后ღ◈， 吸取一定量的混合液ღ◈， 从测试孔滴到 加样部件上ღ◈， 在层析作用下ღ◈， 样本从加样部件到达检测部件ღ◈。 样本中若存在肌酸激酶同工酶 CK-MBღ◈， 则其ღ◈。

　　36ღ◈、会与肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物形成复合体ღ◈， 再与检测线 上的肌酸激酶同工酶CK-MB多克隆抗体结合ღ◈， 在检测线上形成荧光免疫复合物ღ◈， 样本中肌酸 激酶同工酶CK-MB的浓度与上述荧光信号成正比ღ◈， 同时以质控线荧光信号强度校正检测线 的荧光信号强度及信号ღ◈， 从而实现肌酸激酶同工酶CK-MB的定量检测ღ◈。 0124 一种具体的本发明的检测试剂盒的制备方法ღ◈， 包括步骤ღ◈： 0125 a.将鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物与缓冲液A混合ღ◈， 其中荧 光微球质量浓度为0.1-0.5mg/mLღ◈； 0126 b.将上述混合液定量精确分装在六三孔加样杯中ღ◈， 分装量在每预制杯2.5-ღ◈。

　　37ღ◈、10 Lღ◈， 并置于线hღ◈， 干燥后将六三孔加样杯板冲切成独立的含有鼠源肌 酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的加样杯ღ◈； 0127 c.将样品垫ღ◈、 包被有鼠源肌酸激酶同工酶CK-MB多克隆抗体ღ◈、 羊抗鼠IgG多克隆抗 体的硝酸纤维素膜ღ◈， 吸液垫组装在PVC底板上ღ◈， 并切割成固定宽度的试剂卡ღ◈； 和 0128 d.将含有鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的加样杯ღ◈， 固定宽 度的试剂卡ღ◈， 塑料件按照组装操作手册ღ◈， 组装成可用于检测肌酸激酶同工酶CK-MB的试剂 盒ღ◈。 0129 本发明的主要优点包括ღ◈： 0130 1.本发明中加样部件的存在ღ◈， 使得样本中的肌ღ◈。

　　38ღ◈、酸激酶同工酶CK-MB可与肌酸激酶 同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物充分反应并结合ღ◈， 同时ღ◈， 可降低结合垫型结构的固相 结合物复溶不均的现象造成检测重复性较差的问题ღ◈。 0131 2.所述肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物在本发明优化的缓冲液中 形成的溶液在加样容器中干燥后形成的固相混合物可以快速ღ◈、 充分的复溶ღ◈， 可节省检测时 间ღ◈， 并进一步提高检测的重复性和准确度ღ◈。 0132 3.本发明制备的肌酸激酶同工酶CK-MB免疫荧光层析试剂盒反应时间短ღ◈， 重复性 好ღ◈、 灵敏度高ღ◈、 准确度高的优点ღ◈， 且操作简单和经济实用ღ◈。 0133 下面结合具体实施ღ◈， 进一步阐述本发明ღ◈。 应理解ღ◈， 这些实ღ◈。

　　39ღ◈、施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围ღ◈。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法ღ◈， 通常按照常规条件ღ◈， 或按照制造厂商所建议的条件ღ◈。 除非另外说明ღ◈， 否则百分比和份数按重量计算ღ◈。 0134 试剂 0135 羧基荧光乳胶微球ღ◈： 可购自苏州为度ღ◈， 固含量1ღ◈， 直径100-400nmღ◈， 绿色荧光ღ◈， 激发 波长为488nmღ◈， 发射波长为520nmღ◈； 0136 鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体ღ◈： 市售ღ◈， 外观澄清溶液ღ◈， 无不溶物或冻干干粉ღ◈； 浓度1.0mg/mLღ◈； 蛋白电泳检测纯度大于90ღ◈。 0137 实施例1 0138 鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的制备过程中的溶液配制ღ◈： 0ღ◈。

　　40ღ◈、139 a.封闭液的制备ღ◈： 称取0.0992g磷酸氢二钠ღ◈、 0.0358g磷酸二氢钠溶解于80mL水中ღ◈， 说明书 7/11 页 10 CN 111879930 A 10 振荡混匀ღ◈， 待磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶解完全后ღ◈， 加入2.5g海藻糖ღ◈、 2.5g甘油和0.1g叠氮 钠ღ◈， 震荡混匀ღ◈， 用盐酸和氢氧化钠将pH调节至8.5ღ◈， 最后室温定容至100mLღ◈。 0140 b.配置缓冲液Bღ◈， 缓冲液B的配方ღ◈： PB(磷酸盐缓冲液)的摩尔浓度为10mMღ◈， 海藻糖的 质量浓度为2.5ღ◈， 甘油的质量浓度为2.5ღ◈， 叠氮钠的质量分数为0.1ღ◈， pH调节至8.5ღ◈。 0141 实施例2 0142 肌酸激酶同工酶CK-ღ◈。

　　41ღ◈、MB免疫荧光层析试剂卡的制备方法 0143 1.通过离心ღ◈、 洗涤将荧光微球(羧基荧光乳胶微球)溶液置换成pH5.57.0的标 记缓冲液ღ◈； 0144 2.加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)活化荧光乳胶微球ღ◈， 反应完成后ღ◈， 离心去除上清液ღ◈， 再洗涤一次ღ◈； 0145 3.加入鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体和活化的荧光乳胶微球反应ღ◈， 反应完成 后ღ◈， 离心去除上清液ღ◈， 再洗涤一次ღ◈， 得到鼠源肌酸激酶同工酶单克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈； 0146 4.用上述封闭液封闭所得得鼠源肌酸激酶同工酶单克隆抗体-荧光微球偶联物ღ◈， 室温封闭1小时后ღ◈， 离心去ღ◈。

　　42ღ◈、除上清液ღ◈； 0147 5.将经封闭的鼠源肌酸激酶同工酶单克隆抗体-荧光微球偶联物保存在荧光保存 液中ღ◈， 保存浓度为0.5mg/mlღ◈； 0148 6.将经封闭的鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物加入所述缓冲 液B中ღ◈， 振荡混匀ღ◈， 每个预加样杯中滴加5微升混合液ღ◈， 线mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗体和1.5mg/ml鼠源肌酸激酶同工酶CK-MB多克隆 抗体分别用包被液包被ღ◈， 用喷金划膜仪以1.0mm条带状分别固定于硝酸纤维素膜上ღ◈； 0150 8.在PVC底板上先后贴上硝酸纤维素膜ღ◈、 吸液垫和样本垫ღ◈， 之后切割成3.2mm宽ღ◈， 装 入卡盒中ღ◈， 同时将预加有有ღ◈。

　　43ღ◈、鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的预加样 杯放入到卡盒中ღ◈， 之后将试剂卡卡盒合上压片ღ◈， 命名为杯孔式试剂卡aღ◈。 0151 一种本发明的试剂卡的结构如图1所示ღ◈。 0152 对照试剂卡bღ◈： 结合垫式试剂卡ღ◈， 所用抗体和荧光微球与上述试剂卡相同ღ◈， 不同之 处在于试剂卡中放置鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物的装置的物理结 构不同ღ◈。 前者是杯孔式试剂卡ღ◈， 鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物预先干 燥在加样杯中ღ◈， 再放入到卡盒中组装成成品试剂卡ღ◈， 测试时ღ◈， 样本经稀释后和鼠源肌酸激酶 同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物在杯孔中充分混匀ღ◈， 再滴样至试剂卡加样窗ღ◈。

　　44ღ◈、ღ◈； 而对照 试剂卡b是本领域常用的结合垫式试剂卡ღ◈， 其中ღ◈， 经封闭的鼠源肌酸激酶同工酶MB单克隆抗 体-荧光微球偶联物加入所述缓冲液B中后ღ◈， 固定于上样部件(结合垫)上ღ◈， 测试时ღ◈， 样本稀释 后直接加样至试剂卡加样窗ღ◈。 0153 实施例3 0154 不同试剂卡检测数据对比 0155 将本发明的试剂卡a和对照试剂卡b进行检测效果对照ღ◈。 0156 试剂卡a检测方法ღ◈： 将临床样本置于I-Reader S仪器的探针下ღ◈， 探针没入样本液 面ღ◈， 按下吸样键ღ◈， 5s后ღ◈， 移走临床样本ღ◈。 探针自动移入稀释液中ღ◈， 吸取稀释液后ღ◈， 稀释样本ღ◈， 得 样本稀释液ღ◈， 将样本稀释液注入加样杯中ღ◈， 吹打混匀后ღ◈， 探针自动吸ღ◈。

　　45ღ◈、取60 L加样杯中的混合 液ღ◈， 并自动注入试剂卡加样窗ღ◈， 10min后ღ◈， 仪器自动读取荧光信号ღ◈， 并计算样本中待测物浓 说明书 8/11 页 11 CN 111879930 A 11 度ღ◈。 0157 其中ღ◈， 复合物中的荧光乳胶微球在外界488nm波长的激发光照射下ღ◈， 发射出520nm 波长的荧光ღ◈。 0158 对照试剂卡b检测方法ღ◈， 样本稀释后ღ◈， 直接将本稀释液加样至试剂卡加样窗ღ◈。 0159 检测结果如表1所示ღ◈， 每浓度重复10次测试ღ◈。 0160 表1 0161 0162 从表1中可以看出ღ◈， 本发明的将肌酸激酶同工酶MB单克隆抗体-荧光微球偶联物预 加样于加样容器中ღ◈， 与现有技术中将检测试剂固定ღ◈。

　　46ღ◈、于结合垫中的方案相比ღ◈， 由于本发明采 用的加样容器不会与所述偶联物结合ღ◈， 在加入液体样本后可以最大程度的复溶ღ◈， 更加可控ღ◈， 结果显示ღ◈， 本发明试剂卡的其检测结果的变异系数5ღ◈， 与对照组相比贝博ballbet体育ღ◈， 降低5-8ღ◈， 说明 本发明的试剂卡具有显著提高的重复性(精密度高)ღ◈。 0163 同时ღ◈， 两组的信号值相比ღ◈， 本发明的试剂卡的结果也明显高于对照试剂卡的信号 (约高出20左右)ღ◈， 说明本发明的试剂卡的检测灵敏度也明显高于对照试剂卡ღ◈。 0164 实施例4 0165 进一步比较本发明的试剂卡a和对照试剂卡的检测灵敏度ღ◈。 0166 结果如表2所示ღ◈。 0167 表2 说明书 9/11 页 12 CN 1118799ღ◈。

　　47ღ◈、30 A 12 0168 0169 0170 从表2可以看出ღ◈， 0.3ng/mL的检测信号值与不含肌酸激酶同工酶CK-MB的样本(空 白ღ◈， 0ng/ml)检测信号值的差值ღ◈， 本发明的试剂卡要明显高于对照试剂卡ღ◈， 本发明试剂卡的 信号差值比对照试剂卡信号差值高2.5倍以上ღ◈， 这说明本发明的试剂卡的检测灵敏度明显 优于对照试剂卡ღ◈。 0171 实施例5 0172 本发明的试剂卡a和对照试剂卡对临床样本(血浆样本)进行测试ღ◈， 参考值来自为 说明书 10/11 页 13 CN 111879930 A 13 化学发光试剂平台(Beckman ACCESS 2测试系统ღ◈， 其检测范围为0.1ng/mL-300ღ◈。

　　48ღ◈、ng/mLღ◈。 0173 结果如图2所示ღ◈。 本发明的试剂卡与对照试剂卡测试临床样本后ღ◈， 测试值与参考值 进行相关性比对ღ◈， 本发明的试剂卡与参考值的相关性0.97ღ◈， 明显优于对照试剂卡的0.88ღ◈， 说明本发明的试剂卡具有优异的准确性ღ◈。 0174 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考ღ◈， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样ღ◈。 此外应理解ღ◈， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后ღ◈， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改ღ◈， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围ღ◈。 说明书 11/11 页 14 CN 111879930 A 14 图1 图2 说明书附图 1/1 页 15 CN 111879930 A 15 ღ◈。机械动力ღ◈。贝博betball登录贝博betball登录官网ღ◈！贝博betball官网ღ◈！发动机